Kako uporabljati raven GSH pri odkrivanju ROS

glutation, ali GSH , jenebistveno Tripeptid narejen iz cisteina, glutamata in glicina . To jemočan antioksidant, ki ščiti celice in organe vašega telesa pred škodljivimi učinki ROS , ali reaktivnih kisikovih zvrsti , ki so nastale iz molekularnega kisika zaradi različnih presnovnih procesih v telesu . Antioksidantov, kot so glutation , nevtralizirajo ROS in jim preprečujejo interakcijo z in poškodovali DNA in proteinov v celicah . Razmerje med oksidirano in zmanjšano obliki GSH v vašem telesu kaže povezane - ROS oksidativnega stresa v vaših body.Things boste potrebovali
brizgo,
Butterfly iglo jezik centrifuga
Natrijev heparin
Zamrzovalna
sulfosalicilno kislino
GSH reakcija, katere agent
mikroplošči
vir svetlobe
GSH standardne raztopine
Proste Prikaži več navodil

1

Draw približno 2 ml krvi , ki jih venepunkcija na anticubetal vene z 23- gauge metulj iglo v 5 ml brizgo . Dodaj vzorec za preizkušanje cevi , ki vsebujejo natrijev heparin in rahlo obrnemo epruveto za mešanje .
2

Zberite rdeče krvne celice s centrifugiranjem vzorca pri 2500 vrtljajih na minuto, za pet minut . Zamrznitev in odtajevanje Vzorec trikrat , da bi prekinil celice . Centrifugira rešitev celični lizat 10 minut pri 12.000 obratih na minuto in 4 stopinje , in zberemo supernatant .
3

Odstranite beljakovin iz vzorca z dodatkom 5 odstotkov sulfosalicilno kislino in centrifugiranje vzorca 12.000 rpm za pet minut in pri 4 stopinjah . Hranite deproteinated supernatanta pri -112 stopinjah .
4

Mix odkrivanja sredstvo tiolni , GSH reduktazo, nikotinamidadenindinukleotidfosfata in pufru za preizkus v razmerjih , ki jih proizvajalec kit navedene, da bi reakcijsko zmes GSH . Znesek posamezne kemikalije je odvisna od števila preiskav, ki jih nameravajo izvesti . Reakcijsko zmes razredčimo GSH v 5 -odstotni sulfosalicilno kislino , da se koncentracije 16 , 32 , 63 , 125 , 250 in 500 ul .
5

med 1 do 10 mikrolitri deproteinated vzorca krvi v vdolbinice v mikroplošče . Dodaj serijsko razredčene standardne raztopine GSH , ki je na voljo v kompletu testiranje , da se vsak dobro , da celotno količino vsake tudi do 10 pl .
6

Dodajte 90 mikrolitri GSH reakcijske mešanice , ki ste jih naredili v stopnji 4 v vsako jamico v mikroploščice . Zmešajte reagent s stresanjem ploščo za 30 sekund .
7

takoj izmerite absorbanco z dajanjem ploščo pod svetlobo z valovno dolžino 405 in 415 nanometrov . Inkubiramo Plošča za 30 minut . Bodite absorbance odčitke po vsakih pet minut med inkubacijo .
8

razredčite 6 milimolaren predelanega vzorca s 5 -odstotnim sulfosalicilno kislino in trifluromethane -na rešitev. S tem boste odstranili vse znižano GSH je iz raztopine . Dodajte 1 do 10 micoliters te rešitve, da se vodnjakov mikroplo in ponovite koraka 5 , 6 in 7 . To bo pomagalo oceniti znesek oksidiranega GSH v vzorcu .
9

Izdelamo absorpcijo in vzorec koncentracije na graf za pridobitev krivuljo GSH tako za zmanjšano in oksidiranega glutationa . Izračunajte razmerje med obema oblikama GSH . Povišane ravni oksidativnega vrednosti GSH kažejo, oksidativni stres in ROS .