TOPO Kloniranje Protokoli

TOPO Kloniranje jepostopek kloniranja , ki uporablja splošno , 3 ' ostanke , ki so termodinamsko nestabilne in jih kombinira s polimerazo Taq DNA . Poleg tegapostopek uporablja sveže verižne reakcije s polimerazo proizvod ( PCR) , ki mora biti shranjena pri 4 stopinjah Celzija . Ta oblika kloniranja optimizira aktivno topoizomeraze I molekula dodano na koncu linearne vektorja . Za opravljanje Topo kloniranje , bi bilogotovo, protokol je treba upoštevati. Priprava

je mogoče sprejeti nekaj osnovnih korakov, da se pospeši celoten TOPO kloniranje proces in pomaga zagotoviti uspeh . Najprej se je treba cevi živih celic postavi na led , da se ohrani njihovo sprejemljivost . Dalje, super optimalna kulture ( SOC ) medij , bakterijske rasti , obogaten s hranili , se segreti na sobno temperaturo . Selektivni plošče je treba nato predhodno segreli na 37 stopinj Celzija , tako da so v celoti pripravljeni, ko pride čas za njihovo uporabo .
Združevanje Sestavine

Za začetek kloniranje Postopek naj bikombinacija 2 ul verižno reakcijo s polimerazo ( PCR ) proizvoda , 0,5 ul raztopine soli , in 0,5 ul kloniranje vektorja se združi v centrifugirki 0,5 - ml . Ko kombinaciji , bo treba te snovi določi na sobni temperaturi in pustimo inkubirati 9:55 minut . Nato se bodo združene sestavine dodajo " Top- 10 , kemično kompetentnih celic " v 50 - mikrolitrov cevi in damo na led zadodatnih deset minut . Po tem, se morajo celice toplotna šokiran nad 42 stopinj Celzija točno in damo na led še dodatno minuto , preden se doda 180 ul SOC medija. Ta mešanica je treba nato stresamo v vodoravni smeri, pri 200 rpm dodatno uro pri 37 stopinjah Celzija .
Končne koraki

Zmes 50 ul in 100 mikrolitrov vsake reakcije, je treba zasadimo " na LB + AMP + X - Gal plošče in inkubiramo brez stresanju preko noči pri 37 C " Naslednji dan tri bele kolonije iz vsake reakcije, je treba izbral in postavi v 4 ml LB + AMP in pustimo preko noči inkubiramo pri temperaturi 37 stopinj Celzija , medtem ko se stresali pri 200 vrtljajih na minuto . Zadnji korak jemini - priprava plazmidov in čaka, da vidi, ali je bilpostopek uspešen .